28种药物对斑点叉尾鮰维氏气单胞菌的抑菌作用研究及最佳药物推荐

28种药物对斑点叉尾鮰维氏气单胞菌的抑菌作用研究及最佳药物推荐

不同药物对凡尔氏气单胞菌水产养殖的抑菌作用研究 2006 导师于树平：**李 摘要：以28种常见药物为材料，测定了它们对斑点叉尾鮰体内凡氏气单胞菌的生物活性，结果表明，28种化学药物中，检测试剂，环丙沙星、氟苯尼、四环素、奥法辛、米氟沙星等共14种，洛美沙星和左氧氟沙星对该细菌有很强的抑制作用。但以往水产养殖中常用的四环素、青霉素、红霉素等对此病原菌没有作用。抗菌作用或效果不明显，说明病原菌可能对其产生耐药性，不适宜作为其抗菌药物。关键词：斑点叉尾鮰抗菌活性 MIC 简介：斑点叉尾鮰是温水性淡水鱼，适宜温度范围为0-38℃，生长和摄食温度为5-36℃，最适生长温度为18-18℃。 34°C。最佳饲养温度为18-30℃。当水温超过39℃时，就会出现呼吸减慢、动作迟缓等不良反应。溶解氧为3mg/L时可正常生长，低于0.5mg/L时会死亡。对pH值的适应范围为6.5-9.0，对盐度的适应值应小于1‰[12]斑点叉尾鮰的口齿和喉齿密而薄。它是一种有胃的鱼，动作敏捷，颜色鲜艳。更深。一般认为它是肉食性鱼类。在我国有较大的养殖面积，具有良好的经济价值。但随着养殖面积的不断扩大和养殖水环境的恶化，斑点叉尾鮰的疾病日趋严重，给广大渔民造成巨大的经济损失。

【3】目前控制水产动物细菌性疾病的主要手段是采用抗菌药物治疗。但由于对病因、药理等方面认识不完全，在养殖过程中存在滥用、乱用药物的情况，如多种药物大剂量混合使用等。虽然对病原菌有一定的杀灭作用，但毒副作用明显，长期使用，极易导致病原微生物产生耐药性。因此，在使用药物治疗细菌性疾病之前，必须测定药物对病原菌的敏感性。 [4] 大多数水生病原体药物敏感性研究采用测量MIC和MBC等方法。目前报道的MIC测定方法有液体法、平板法、倾斜法等。由于液体法无法测定难溶性药物的MIC，因此较少使用，多采用平板法。最常用的平板法是将细菌播种在含有药物的平板上。足够浓度的药液可以抑制细菌的生长，可以快速筛选药物。倾斜法是在一系列试管中以双倍比例使用普通肉汤培养基。用稀释法稀释药液时，在每管中加入等量的含菌普通肉汤和适量琼脂。用2.6%琼脂培养基使最终菌量为104CFU/ml，摇匀，置于斜坡上；在适宜的温度下培养16-18小时，观察实验结果，记录无菌生长的最低药物浓度，即为药物的最低浓度。抑菌浓度[1].1：材料与方法 1、试验材料 试验对象：斑点叉尾鮰体内的花斑气单胞菌（四川农业大学实验室） 主要试剂：药敏纸片、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、蒸馏水、主要仪器：光学显微镜、培养皿、镊子、烧瓶、酒精灯、pH试纸、平板。

2 试验方法 2.1 实验准备 2.1.1 培养基配制采用如下配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。将除琼脂外的所有成分溶解在蒸馏水中，校正 pH，添加琼脂，等分到培养皿中，在 121°C 下高压灭菌 15 分钟，备用。 2.1.2药敏试验[5]将28℃恒温培养18～24小时的菌落用生理盐水制成105CUF菌悬液，均匀涂于平皿上，贴上药敏试纸，放入恒温箱中24小时。观察并制表。抑菌圈直径≤14mm为敏感，15-17mm为中度敏感，≥18mm为高度敏感。实验重复三次。 2.1.3 氟苯尼考等4种敏感药物MIC的测定[6] 取菌悬液1ml，加入装有8ml液体培养基的无菌试管中；然后取各药敏纸原药稀释后各溶液5ml（6.4mg/ml）沿管壁注入装有5ml灭菌生理盐水的灭菌试管中，摇匀，制成溶液。 2倍稀释。按照上述操作顺序，制作6个浓度梯度，其浓度分别为：0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02mg/ml；然后从6个不同浓度梯度试管中吸取1ml药物稀释液，加入各种细菌稀释液中混匀，置于28℃培养箱中培养24小时。取出后观察并测定最低抑菌浓度（MIC）并制成表格。

2 结果与讨论 2.1．药敏试验：采用纸片法对致病菌花斑气单胞菌进行药敏试验。结果见表1。 表1：不同药物对凡尔纳气单胞菌的抑制作用。名称代码 抑菌区半径 cm 药物含量 数量敏感性判断标准 乙酰螺旋霉素 B 1.0 磺胺异恶唑磺酸盐 2.3 氯霉素 氯 2.4 四环素 四环素 1.8 洛美沙星 Ro 3.0 多粘菌素 0.7 新生霉素 0.7 链霉素 链霉素 2.1 阿米卡星 霉素 1. 6克林霉素 0.6 妥布霉素 1.6 麦迪霉素 0.9 新霉素 1.1 米诺环素 1.2 氟苯尼康尼 3.1 奥罗夫星 2.5 美孚鲜美 2.7 青霉素 青霉素 0.7 恩诺沙星 En 2.4 利福平 1 .5 左氧氟沙星 3.2 红霉素红 1.8复方磺胺甲恶唑 2.3 卡那霉素 卡那霉素 1.8 克拉霉素克 1.8 呋喃唑啉痢疾 1.2 环丙沙星环 2.9 阿奇霉素 2.6 注：每药含剂量为 30ug/片。 2.2 MIC值测定：从药敏试验结果中选择4种抗菌能力较好的药物，采用两倍稀释法测定白癜风气单胞菌菌株的MIC值（表2）。表 2：针对维氏气单胞菌药物的 MIC 值 药物 mg/ml0.640.320.160.080.04 MIC 值 mg/ml 氟苯尼考+++++-+--------0.64 环洛芬 氟沙星++++--+-------- 0.64 恩诺沙星++++------------0.64 左氧氟沙星 氟沙星 +++++-+--------0.32 “+++”代表对药物极度敏感 “++”代表对药物敏感 “-”代表对药物不敏感 3 我国畜牧水业分析 行业发展迅速。据统计，2004年全国肉、蛋、奶总产量分别达到724.418万吨、272.317万吨、236.814万吨。畜牧业总产值突破1万亿元，禽蛋、肉类产量居世界第一；水产品总量也连续多年位居世界第一，2005年产量超过4000万吨[7]。

了解我国养殖业抗生素使用现状，为控制和限制抗生素使用提供科学依据，对于促进我国畜牧养殖业健康有序发展，生产安全畜牧水产品具有重要意义。抗生素在养殖业中的使用。 1 饲料抗生素作为生长促进剂 1. 1 饲料抗生素的发展 自1949年抗生素首次用于饲养仔猪和雏鸡以来，饲料抗生素的应用已有近60年的历史。 20世纪60年代以后，人们逐渐认识到细菌耐药性的发生和转移机制以及饲料抗生素对人体健康可能产生的危害。有人提出饲料抗生素应与人用抗生素分开，并开始研制专用饲料抗生素。 20世纪80年代进入第三阶段，重点筛选开发无残留、无毒副作用、无耐药性的特种饲料抗生素，并与人用抗生素分离，确保饲料抗生素的绝对安全。 1. 2 饲料抗生素问题 由于使用抗生素作为生长促进剂引起病原菌的耐药性以及动物及其产品中抗生素残留问题，世界范围内取消饲料抗生素的呼声日益高涨[8] ，9]。事实上，世界上许多国家都限制或禁止在饲料中使用青霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、庆大霉素等抗生素。仍在使用的抗生素，特别是在人类和牲畜中共用抗生素也受到严格限制。 2 养殖业滥用抗生素的危害 2. 1 抗生素残留对人体的直接影响。人体经常摄入低剂量的抗生素残留，这些残留物会逐渐在体内积累，引起各器官的病变。

抗生素残留对人体的影响主要表现在过敏反应、变态反应、免疫抑制、致畸、致癌、致突变等[10]。有报道称，食用含有 10、4、2、0.106 或 0.103 IU öml 青霉素的牛奶后会出现过敏反应，例如大范围瘙痒、皮疹和头痛。人们在屠宰前 3 天食用经过青霉素处理的新鲜猪肉后出现皮疹（猪肉中含有青霉素 0145 IU ög）[11]。氯霉素可对人体肝脏和骨髓的造血功能造成损害，导致再生障碍性贫血、血小板减少、粒细胞减少、肝脏损害等。呋喃唑酮及其代谢物可导致动物致癌。为此，联合国粮食及农业组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）和美国食品药品监督管理局（FDA）禁止在食用动物饲养中使用氯霉素和呋喃唑酮。 2. 2 抗生素残留对人体的间接影响 抗生素的代谢途径有多种，但大多主要由肝脏代谢，通过胆汁随粪便排出。一些稳定的抗生素会排泄到环境中，造成环境中的药物残留。这些残留药物可通过畜禽产品直接在人体内蓄积，或通过环境释放在其他植物中蓄积，最终通过多种途径在人体内蓄积[11]，导致人体内产生慢性毒性作用和耐药性。体内正常菌群。性变化。 2.3 细菌耐药性对人类的危害 由于抗生素在食用动物养殖中的广泛使用，细菌耐药性问题日益严重和复杂。

细菌耐药性不仅降低抗生素的疗效，表现为药物剂量增加、疗程延长、复发率增加，而且还会引起并发症，增加死亡率。 1997年，美国明尼苏达州空肠弯曲菌感染流行期间，卫生部门报告对超市的鸡肉和火鸡肉进行了随机检查。鸡污染率达70%，分离菌株中有20%产生耐药性；火鸡的污染率为70%。 58%、84%对用于治疗弯曲菌病的抗生素具有耐药性。流行病学调查证明，患者多因食用未煮熟的肉类所致[12]。据世界卫生组织最新统计，食源性疾病的实际数量是报告病例数的300至500倍，全球因食品污染而患病的人数已达数亿人[13]。耐药性从动物源性耐药菌向人类转移，对人类健康产生巨大影响，甚至威胁人类生命。 1997年美国明尼苏达州发生的弯曲杆菌感染疫情引起人们恐慌。这是一个重要原因。弯曲杆菌对氟喹诺酮类药物具有严重耐药性，氟喹诺酮类药物广泛用于人类治疗由弯曲杆菌引起的疾病。养殖业使用抗生素的主要目的是治疗细菌性传染病、预防细菌性传染病的发生（使用剂量低于治疗剂量）和作为饲料添加剂促进动物生长（用量一般为1ö10～治疗剂量的 1ö5）。

虽然抗生素的使用可能会降低养殖成本，但长期使用抗生素会诱发耐药菌的出现[14]，特别是在动物中，长期使用亚治疗剂量（如预防剂量和预防剂量）的抗生素。促生长剂量）可以加速耐药细菌的产生。的出现。一旦养殖动物体内出现耐药菌并在动物间传播，规模化养殖动物将成为巨大的耐药基因库。例如，最近从美国商业鸡中分离出的沙门氏菌和空肠弯曲菌已普遍对多种抗生素产生耐药性。耐药性 [14, 15]。研究表明，食品中的耐药菌可以直接或间接传播给食用动物的最终消费者人类，对人类临床感染的治疗造成严重威胁。 3 养殖业滥用抗生素的经济影响。禁用抗生素生长促进剂可能会导致养殖成本增加。主要原因一是由于动物发病率增加和治疗费用增加，二是因为使用新型饲料添加剂的成本高于抗生素，三是因为更严格的饲养管理会增加管理成本。美国数据估计，停止使用抗生素饲料添加剂将使肉鸡生产成本每年增加30亿美元[16]。据统计，瑞典和丹麦完全停止使用抗生素作为猪饲料添加剂后，猪肉价格上涨了约3%。有数据估计，畜牧业禁用抗生素后，猪肉和牛肉的价格可能分别上涨3美分/磅，鸡肉价格上涨1美分/磅[17]。

此外，2007年公布的700万只家禽养殖调查显示，停止使用抗生素作为饲料添加剂，不会增加养殖业成本，也不会影响市场有效供给。丹麦禁止使用抗生素添加剂后，鸡体内耐万古霉素肠球菌数量从80%减少到10%，从猪身上分离出的耐万古霉素菌株数量从65%减少到25%，导致成本下降节省 2550 万美元[17]。值得注意的是，畜牧业禁用抗生素增加的成本对经济和人类健康的影响比每年300亿美元的抗生素使用成本和9000人死亡更为重要。 4 养殖业抗生素滥用及食源性疾病耐药情况 国家食源性疾病监测网络数据显示，1992年至2001年十年间，监测网络区域食源性疾病发病率总体呈下降趋势。微生物是主要致病因素，其中Arc．副溶血性杆菌。在622株腹泻病原菌耐药性调查中，弧菌科分离率最高，为458株，占3414%；肠杆菌科细菌分离率最高，有140株，占1011%。弧菌、志贺氏菌和沙门氏菌对磺胺甲恶唑和氨苄青霉素的耐药率高达85%～90%[18]。水产养殖中小剂量、长期使用抗生素，很容易导致耐药菌株的出现和蔓延。

调查表明，与水生动物感染有关的副溶血弧菌、溶藻弧菌、鲷弧菌、嗜水气单胞菌等对常用抗生素氨苄青霉素、复方磺胺甲恶唑、四环素、氯霉素、环丙沙星等非常敏感，已产生一定程度的耐药性。 ，并且逐年有不同程度的增加[19-21]。美国有数百万人患有食源性疾病，其中 3215 万人住院治疗，5000 人死亡[22]。在英国，6万名食源性患者住院，1800人死亡[23]，其中主要食源性病原体为大肠杆菌O157、空肠弯曲菌和沙门氏菌。每年直接和间接经济损失达14亿美元，196万患者承担的费用达7亿美元，特别是耐药菌株引起的感染。研究表明鸡、猪分离株的耐药性与畜牧业抗生素的使用有关[24, 25]。其中，耐万古霉素肠球菌与阿伏霉素在食源性动物中的使用密切相关[26, 27]。此外，畜牧业抗生素的使用与人类分离株的耐药性之间存在一定的相关性，这一点已被许多研究证实[28, 29]。 5、养殖中病原菌耐药性检测。为了检测抗菌药物对病原菌的敏感性，通常采用MIC作为抗菌药效的评价指标。 [30]本研究采用28种药物测定了维氏气单胞菌的抑菌圈，结果显示受试菌对左氧氟沙星、氟苯尼考、环丙沙星、罗哌星、阿奇霉素均产生耐药。对奥芬、复方新诺明、链霉素、氯霉素、恩诺沙星、磺胺异恶唑、美菲辛等 5 种药物高度敏感。 7 对乙酰螺旋霉素、四环素、青霉素、多粘菌素、利福平、新生霉素、红霉素、阿米卡星、克林霉素、卡那霉素中度敏感，有16种低敏感性药物妥布霉素、克拉霉素、麦地霉素、呋喃唑烷、新霉素和米诺环素。

众所周知，不同类型的病原体对各种化学药物（尤其是抗生素）敏感，试验菌对来氟沙星、氟苯尼考、环丙沙星、洛美沙星等药物的敏感性可能是由菌株本身决定的，其对既往药物的耐药性也可能决定。水产养殖常用的四环素类、青霉素类、红霉素等对此病原菌无抗菌作用或无明显作用，表明病原菌可能对其产生耐药性，不适宜作为其抗菌药物。实际应用中，最好在饵料中添加恩诺沙星或氟苯尼考等药物进行防治。相同的病原菌对不同类型的抗菌药物产生耐药性的速率不同，不同的病原菌对同一类型的抗菌药物产生耐药性的速率也不同。萨古庆等.用鳗弧菌求得氯霉素的得率。试验结果表明，随着药物浓度的增加，连续传代10次后，鳗弧菌对氯霉素的耐药性增加了4倍[31]。青木等人。研究结果证明，迟缓爱德华氏菌经过15次传代培养后，对氯霉素的耐受性获得率提高了125～250倍。 【32】我国水产医学基础理论还相当薄弱。渔药使用安全是水产养殖业的重要问题，已引起社会的高度关注。水产品药物残留问题引起社会广泛关注。为什么会出现高级药物？残疾人？这大部分是因为农民在长期使用传统抗菌药物的过程中，增加了病原菌的抵抗力。要治愈疾病，必须增加更多的药物剂量； [33]因此，有必要控制水产品中的药物使用。确保水产品安全，必须注重渔药的安全使用和科学管理。

近年来，氯霉素、恩诺沙星、孔雀石绿等渔药安全使用相关事件时有发生，是长期不科学使用渔药引发的矛盾集中爆发[34]。现在我国制定了《水产养殖质量安全管理条例》、《水产苗种管理办法》和《农产品质量安全法》，为水产品质量安全管理提供了保障，包括利用渔业资源。药物、药物残留限量和鱼饲料安全限量等水产品质量安全相关基础标准制定取得突破性进展[35]。随着全面建设小康社会，我国人民生活水平不断提高，生活质量将日益提高。特别是肉、蛋、奶等动物源性食品的消费安全和质量越来越受到重视，动物源性产品的消费受到限制或彻底杜绝。对于抗生素残留，必须有法可依，加强养殖、流通、销售环节监管。如今，应进一步深化药代动力学和药效学研究，探索水产药物在水产动物体内的代谢规律。只有明确了渔药的药效、毒性和浓度之间的关系，确定了渔药在体内的蓄积场所和部位，确定了蓄积程度，才能安全合理地使用渔药，合理的停药期。为临床安全和合理用药提供依据，为剂型选择和新药开发提供方法。方向，研究药物对病原菌的敏感性也必须作为鱼药安全使用的重要方面予以重视。病原菌药物敏感性研究是一项很有前景的技术，可以为病原菌的预防和治疗提供指导。 [36]，对于新出现的斑点叉尾鮰病尚无良好的防治方法，对其敏感性的研究可为实际生产中防治该病提供依据。

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