维氏气单胞菌灭活疫苗研究薄弱，水产动物疾病防治待加强

维氏气单胞菌灭活疫苗研究薄弱，水产动物疾病防治待加强

伟哥鱼注入的疫苗的准备和使用及其使用

【技术领域】

[0001]本发明属于预防和控制水生动物疾病的技术领域，并涉及一种制剂和使用AVA捕鱼注射疫苗的方法。

【背景技术】

[0002] Aeromonas Vickers was first identified at the US Centers for Disease Control and Prevention in 1983. It has typical virulence factors of Aeromonas, such as aerolysin, enterotoxin, a series of adhesion factors, phospholipase, serine protease, etc. Aeromonas Vickers is a pathogenic bacteria that co-infects humans and fish.在影响水生产品质量的同时，它也对人类健康和安全构成威胁。自21世纪以来，由Aeromonas Vickers引起的水产养殖动物的致病状况显示出了上升的趋势，并且有关鱼类感染和大量水生动物死亡的报道逐渐增加。近年来水生产业的发展趋势一直是疫苗预防疾病的使用。我国的捕鱼疫苗研究非常薄弱，只有少数商业水生动物疫苗被批准使用。在中国，尚未报道过关于灭活气管维克斯疫苗的研究。目前，鱼类容易受到气压维克斯的影响，但它们没有低成本，易于准备和良好的预防疫苗来免疫鱼类和水生动物，从而导致大量死亡。本发明通过隔离和鉴定获得了气压vick剂，并制备了灭活的疫苗。它在被鱼类免疫后具有良好的免疫保护作用，并且可以有效预防和控制由Aeromonas Vickers引起的鱼类和其他疾病。

【发明内容】

[0003]本发明的目的是为鱼类的Avav注射疫苗提供一种准备方法，并解决由鱼类感染引起的疾病问题。

[0004]本发明的另一个对象是提供一种使用疫苗注射气动作vickers的方法。

[0005]本发明采用的技术解决方案是遵循以下三个步骤：

[0006]①气管维克斯的来源，隔离和鉴定：发明家从蠕虫的发作中隔离了主要的细菌。人工感染后，它证实了它与克鲁克鲤鱼和其他人具有相同的疾病现象，并且具有强烈的致病性。 16sRRNA序列的分子鉴定的主要方法是确定veronii的气瘤菌，结合了分离株菌株的生理和生化鉴定结果。构建了系统发育树，表明细菌的16sRRNA序列和具有较高同源性的前40个菌株为A. veronii，同源性超过99％。因此，选择该菌株以制备A.伟哥灭活的疫苗。

[0007]根据以下步骤进行：

[0008]步骤1：选择一个由Verivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivie选择一个单个菌落

[0009]步骤2：之后，将0.2毫升的细菌溶液用无菌枪尖吸收，并将其应用于普通板上培养，4小时后，用无菌盐水洗涤Aeromonas Vickers；

[0010]步骤3：使用Maxar的浊度法确定细菌浓度，直到用无菌盐水将Ava Vickers的浓度稀释至2.5x109cfu/ml；

[0011]步骤4：添加0.2％甲醛溶液，在恒定温度下24小时在28°C下灭活24小时，在8000R/min的28°C下进行离心和3次洗涤，每次5分钟，在去除其他成分后，将AVNV的浓度稀释至1x 108cfu/ml，并用纯净的盐酸盐均为Avnv Inctiv eavnv Inctiv eavnv Incrial;将4°C的冰箱存放在冰箱中，以供以后使用。

③在捕鱼注射中使用AVAV灭活疫苗的使用方法：制备的AVAV灭活疫苗采用腹膜内注射对健康鱼类的方法，大小和规格为40-60G鱼，接种量为每次注射。

0.2ml疫苗。

[0013]此外，注射是1个免疫注射；或在1个免疫注射后的14日和28天进行第二次免疫注射。

[0014]本发明的有益效应是疫苗可以有效防止气球维克感染鱼类，免疫作用是好的。

[0015]本发明的优点是：

[0016]①在鱼类中制备的AVA的注射疫苗对鱼具有良好的免疫保护作用，并有效防止Avava捕鱼。 Aeromonas Vickers疫苗的免疫试验表明，针对鱼类的免疫保护在70％至90％之间，总体免疫保护量可能超过85％。

②可以从人工感染和鱼类的回归感染测试中，可以看出，选择用于生产渔业注射疫苗的气管菌株具有很强的毒力。在克鲁克鲤鱼的急性毒性测试中，测量了该菌株的半致命量

1.6x 17（细胞）;通过4x 108cfu/ml气ONASVICKERS浓度进行回归感染测试，黑鸟的死亡率为100％。灭活的Aeromonas Vickers疫苗具有良好安全性和易于准备的特征。在确保其安全性的前提下，采用轻度灭活条件，以确保疫苗的抗原性和有效性；该疫苗使用0.2％的甲醛在28°C下灭活24小时，这不仅可以满足完全失活的要求，而且在最大程度上可以保护其免疫原性。

【具体实施方法】

[0018]本发明将在下面与[详细实施例]一起详细描述。

[0019]本发明的Aeromonas Vickers捕捞疫苗的准备和使用方法如下：

[0020] Aeromonas Vickers灭活疫苗的制备：

[0021]步骤1：选择一个由Verivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivi组成的单个菌落

[0022]步骤2：之后，将0.2毫升的细菌溶液用无菌枪尖吸收，并将其应用于普通板上培养，4小时后，用无菌盐水洗涤Aeromonas Vickers；

[0023]步骤3：使用Maxine浊度法确定细菌浓度，直到用无菌盐水将AVA Vickers的浓度稀释至2.5x109cfu/ml；

[0024] Step 4: Add 0.2% formaldehyde solution, inactivate at constant temperature for 24h under 28°C, centrifuge and wash 3 times at 8000r/min, 5min each time, after removing other ingredients, dilute the concentration of AVNV to 1X 108CFU/mL with sterile saline, that is, AVNV inactivated whole bacterial seedlings;将4°C的冰箱存放在冰箱中，以供以后使用。

[0025]用法方法：

[0026]获得的AVAV灭活疫苗通过腹膜内注射将其免疫到健康鱼类中，鱼的大小为40-60g，疫苗接种量为0.2ml每尾疫苗的疫苗。免疫可以是1个免疫注射，或者在1个免疫后可以在14日和28D进行第二次免疫注射。

[0027]实施例1：

[0028]制备的AVA捕捞疫苗用于次要免疫克鲁克鲤鱼并挑战鲤鱼。结果表明，在克鲁克鲤鱼接种后，血清抗体滴度在14天内达到1：320的第一峰，抗体滴度在继发性免疫后增加到1：640。挑战之后，对克鲁克鲤鱼的免疫保护量达到87.5％。疫苗接种后，外周血淋巴细胞，单核细胞，中性粒细胞，吞噬作用百分比和克鲁克鲤鱼的吞噬性指数的百分比显着高于对照组的（p <0.05）（p <0.05），这表明灭活的气象carc胶在croct carce carce carce carce carce carce carce carce carce carce carce carce carce carce carce carcectain scract actune carce carte carte corcectain scroct actune corcnune a corcement carcen corcemune carte cart上均具有良好的影响。

[0029]实施例2：

注射疫苗已经对制备的Avav疫苗进行了免疫和挑战的草鲤，分为原发性免疫组和二次免疫组，结果表明，在草鲤疫苗的疫苗后，血清抗体效率初级免疫组达到了1：320的最大值1：320，在免疫组14d，次级免疫组达到1：640 ID的最大值;在挑战之后，对草鲤鱼原发性免疫组的免疫保护为70.59％，次级免疫组为88.24％，免疫组与对照组显着不同（p <0.05）。向对照组注入疫苗后两个免疫组的外周血淋巴细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞的分类百分比（P <0.05）的百分比（P <0.05）（P <0.05），这表明灭活的气管疫苗疫苗对草鲤鱼具有良好的作用。

[0031]以上只是本发明的首选实施例，对本发明没有任何形式的限制。根据本发明的技术本质对上述实施方案进行的任何简单修改，等效的变化和修改都在本发明的技术解决方案的范围内。

【社会权利】

1。用于捕鱼的AVF注射疫苗的制备方法，其特征是以下步骤：步骤1：选择由AVF形成的单个菌落，在普通的肉汤培养基中进行接种并培养它，形成细菌溶液，在28°C培养12小时，持续12个小时，将AVF培养物培养至最高峰；步骤2：之后，将0.2毫升的细菌溶液用无菌枪尖吸收，并涂在普通板上以培养，然后用无菌盐水清洗AVF。步骤3：通过MAI的浊度法确定AVF浓度，将AVF浓度稀释至2.5x109cfu/ml，用无菌盐水稀释；步骤4：将0.2％甲醛溶液在恒定温度下在28°C下灭活24小时，每次离心并以8000R/min的速度洗涤3次，持续5分钟，然后将AVN浓度稀释至1x 108cfu/ml的浓度，用无菌盐水（这是AVN的整个细菌苗族）;将4°C的冰箱存放在冰箱中，以供以后使用。

2。根据权利要求1使用Avava捕捞疫苗的方法，以此为特征：腹膜内注射对健康鱼类的注射灭活，40-60G的鱼类的大小和疫苗接种量为0.2ml疫苗的疫苗每尾每条尾巴的疫苗量为0.2ml。

3。根据权利要求2使用伟哥捕捞疫苗的方法，其特征是：注射是一种免疫注射；或在一次免疫注射后的第14天和28天进行第二次免疫注射。

[专利摘要]本发明披露了一种用于捕鱼疫苗的准备和使用方法 AVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIV The solution在28°C下在恒温下灭活24小时，在8000r/min的8000R/min上离心3次，然后稀释 AVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIVIV The beneficial effect of the present invention is that the vaccine can有效防止气球维克斯感染具有良好免疫作用的鱼类。

【IPC类别】A61K39-02，A61P31-04

【开放号码】CN104784683

【申请号】cn201510114225

【发明家】Zheng Shuming，Wu Qing，Li Zhengwei

【申请人】西南大学

【开放日】2015年7月22日

【申请日期】2015年3月16日